[摘要] 目的 研究不同脫矿程度牙本质的拉曼光谱特征，为临床应用拉曼光谱技术检测牙本质脱矿情况提供理论基础。方法 方便收集2016年1—5月间厦门大学附属第一医院口腔门诊拔除的下颌智齿10颗，经过打磨去除表面牙釉质，制备牙本质组织标本，经过不同浓度EDTA溶液和不同时间脱矿处理后，分别检测其拉曼光谱，比较不同脱矿程度牙本质拉曼光谱间的差异，并以差异谱峰的对应波数绘制拉曼光谱图像。同时应用能谱仪检测不同脱矿程度牙本质表面的元素含量，验证拉曼光谱结果。结果 该研究共获得不同脱矿程度牙本质特征拉曼光谱共80例。通过比较研究发现，随着牙本质脱矿程度的增加，拉曼光谱中代表磷酸根的960 cm-1波数处谱峰强度逐渐降低，表示牙本质表面磷酸钙盐减少，而代表C-H键的2 950 cm-1波数处谱峰强度逐渐增高，表示牙本质表面有机组织增加。能谱仪元素分析结果也提示随着脱矿程度的增加，牙本质表面钙、磷元素的浓度逐渐降低。结论 不同脱矿程度牙本质组织中磷酸钙盐含量降低，有机组织增加，拉曼光谱可以检测不同脱矿程度牙本质组织成分变化，特别是以2 950 cm-1波数处光谱强度值两两比较差异有统计学意义（P<0.05），可以用于鉴别不同脱钙程度的牙本质，具有良好的临床应用潜力。
[关键词] 牙本质；脱矿；拉曼光谱；鉴别
[中图分类号] R783 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）12（c）-0022-05
[Abstract] Objective This paper tries to study the Raman spectra of dentin with different degree of demineralization， to provide a theoretical basis for the clinical application of Raman spectroscopy in detecting dentin demineralization. Methods 10 mandibular wisdom teeth extracted from the oral clinics of this hospital from January to May in 2016 were convenient collected. After grinding and removing the enamel， the dentin tissue specimens were prepared. After different concentrations of EDTA solution and demineralization treatment， the Raman spectra of the dentin samples were compared and their Raman spectra were compared. The Raman spectra were compared with the corresponding wavenumber of the different peaks. At the same time， the content of element on the surface of dentin with different degree of demineralization was detected by energy spectrometer， and the result of Raman spectroscopy was verified. Results In this study， a total of 80 cases of different characteristics of demineralization of dentin Raman spectra were obtained. Through the comparative study， with the increase of dentin demineralization， the peak intensity of the 960 cm-1 wavenumber representative of phosphate radical in Raman spectrum gradually decreases， indicating that the calcium phosphate salt on the surface of dentin decreases while the 2 950 cm-1 wave number at the peak intensity gradually increased， indicating that the dentine surface organic tissue increases. The results of elemental analysis also indicated that the concentration of calcium and phosphorus decreased gradually with the increase of demineralization. Conclusion The content of calcium phosphate in dentine tissue with different degree of demineralization is decreased and the organic structure is increased. Raman spectroscopy could detect the change of dentin tissue composition with different degree of demineralization. Especially， the spectral intensity at 2 950 cm-1 was compared with each other for The difference was statistically significant（P<0.05）， which can be used to identify the degree of decalcification of dentin， has good potential for clinical application.
[Key words] Dentin； Demineralization； Raman spectroscopy； Identification
临床上牙体缺损修复主要采用树脂、玻璃离子、金属冠及全瓷冠等材料，这些材料与牙体组织通过不同的粘结材料来实现固位[1]。现有的粘结体系是通过酸蚀牙本质，在牙本质表层形成脱矿层，暴露牙本质表层的胶原纤维和牙本质小管，改变牙本质表面性状，使得粘结材料可以渗入牙本质脱矿后的胶原纤维网架和牙本质小管中，形成混合层或树脂突来获得微机械固位力[2]。随着对牙本质表面形态及粘结系统认识的逐渐深入，改善牙本质表面性能的表面处理成为提高粘结性能的关键[1]。牙本质表面采用不同的磨削处理，可以形成不同厚度、密度及其他性质的玷污层，因此不同的牙本质表面处理，会对牙本质与自酸蚀粘结剂之间的粘结强度产生一定的影响[3]。目前，临床应用的粘结体系主要应用酸蚀剂对牙本质表面进行脱矿处理，但尚无针对个体化牙体组织的设计，如硬化性牙本质所需的粘结时间可能较普通牙本质长，且临床上尚无技术或方法能够检测和鉴定不同粘结材料对不同牙本质表面处理程度。拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应的振动光谱技术，通过激发光与散射光波长的变化来反应样本分子结构的改变或组成成分的变化，目前被广泛应用于医学研究领域，如肿瘤组织的鉴别诊断、体液分析、硬组织成分研究等[4-6]。拉曼光谱技术的优点是对测试组织无损伤，无需特别处理，且快速准确，是一种具有实时、快速、无创、准确的检测新方法，特别适用于样本的表面性状研究[7]。因此，该研究拟采用拉曼光谱技术对不同脱矿程度的牙本质表面进行研究，比较不同脱矿程度的牙本质表面光谱差异，以期为临床上应用拉曼光谱检测牙本质酸蚀程度提供理论基础，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
方便收集厦门大学附属第一医院口腔科拔除的下颌智齿10颗作为牙本质组织样本。患者年龄为25～28岁之间，性别比约为1∶1。纳入标准：患者无牙体硬组织疾患，无全身系统性疾病。排除标准：牙本质过敏或牙周炎患者。患者术前均签署了知情同意书，该研究获得厦门大学附属第一医院医学研究伦理委员会的批准。将收集的离体磨牙经过去除表面纤维结缔组织、75%酒精浸泡消毒后，采用TR-26型号（蓝标）车针去除牙体组织表面釉质，TR-13F型号（红标）车针打磨，TR-26EF型号（黄标）车针抛光。再依次使用目数800、1 500、2 000的砂纸对表面进行抛光，去除牙本质表面杂质。然后将牙体组织制备成约5 mm×5 mm组织块备用。
1.2 牙本质的脱矿处理
该研究共收集下颌智齿10颗，每颗智齿共制备2个牙本质组织样本，共20个牙本质样本。首先将未脱矿处理的牙本质样本直接进行拉曼光谱检测，获得特征光谱。之后将牙本质样本依次经过浓度10%EDTA溶液超声震荡浸泡15 min、15%EDTA溶液超声震荡浸泡15 min以及15%EDTA溶液超声震荡浸泡30 min后分别进行拉曼光谱检测，获得不同脱钙程度的牙本质拉曼光谱。
1.3 拉曼光谱检测
将制备好的牙本质标本放置在显微拉曼光谱仪Nanophoton Raman-11载物台，参数设定为785 nm激光为激发光，功率为600 mW，每个牙体组织样本检测区域面积设定为160 μm×80 μm，扫描时间为20 s，平均累加2次取平均值为该样本的拉曼光谱。光谱波数记录范围为400～4 500 cm-1，分辨率为2 cm-1。同时采用Raman Imager软件以光谱波数2 950 cm-1和960 cm-1绘制牙本质的拉曼光谱图像与显微镜下图像进行比较分析。
1.4 能谱仪分析牙本质表面成分
将不同脱矿程度的牙本质组织样本依次通过Quanta-250型X射线能谱仪EDS 进行牙本质组织样本表面成分分析，选取牙本质表面中心区域进行钙、磷、碳、氧、镁等元素成分分析。
1.5 统计方法
采用LABSPEC 2.0软件去除牙本质组织拉曼光谱的荧光背景、消除噪音信号并对光谱数据进行平滑处理。应用Origin 8.0软件对处理后数据进行分析，会診光谱图像，同时通过归一化处理以光谱波数2 950 cm-1和960 cm-1平均光谱强度绘制柱形图，比较不同脱矿程度牙本质的谱峰强度。同时对960 cm-1和2 950 cm-1两个波数处光谱强度进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
该研究共获得未脱矿处理的牙本质组织特征拉曼光谱20例，不同脱矿程度的牙本质组织特征拉曼光谱60例，共80例。通过平均光谱比较可以看出，在450～4 500 cm-1波段区域内，牙本质组织主要表现为960 cm-1与2 950 cm-1两个波数谱峰明显增强，其中960 cm-1表示磷酸根特征谱峰，与牙本质硬组织磷酸钙盐成分相关。而2 950 cm-1表示为C-H键特征谱峰，与牙本质硬组织中有机成分相关（图1）。比较不同脱矿程度的牙本质组织特征拉曼光谱可以发现，随着脱矿程度的逐渐增加，960 cm-1波数处的拉曼光谱谱峰强度逐渐降低，表示牙本质表面的磷酸钙盐成分逐渐减少，而2 950 cm-1波数处的拉曼光谱谱峰强度逐渐增强，表示牙本质表面的有机组织成分逐渐增加（图2）。通过归一化处理的960 cm-1与2 950 cm-1波数处的柱状图同样提示，随着脱钙程度的不断增加，牙本质表面的磷酸钙盐成分逐渐减少，而牙本质表面的有机组织成分逐渐增加。分别以960 cm-1与2 950 cm-1波数处光谱强度两两间进行比较，其中960 cm-1波数处光谱两两比较，差异无统计学意义（P>0.05），而2 950 cm-1波数处光谱两两比较差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
通过Raman Imager软件分别以960 cm-1和2 950 cm-1波数的拉曼光谱强度绘制拉曼图像，与显微镜下图像相比，960 cm-1波数处谱峰表示磷酸盐的含量，图像呈现模糊不清，无法表现牙本质表明情况。而以2 950 cm-1波数处谱峰绘制的拉曼图像，表示了有机组织的含量，与显微镜下图像相比，可以清洗的表现牙本质小孔的结构，与显微镜图像相近，同时随着脱矿程度的不断增加，其拉曼图像表现的牙本质表面小孔的密度越来越高（图3）。
通过能谱仪对不同脱矿程度牙本质组织表面进行元素分析，未脱矿组牙本质组织表面钙和磷的平均相对原子浓度为11.6%和7.6%，而经过浓度10%EDTA溶液超声震荡浸泡15 min后牙本质组织表面钙和磷的平均相对原子浓度为9.5%和6.1%，而再次经过15%EDTA溶液超声震荡浸泡15 min脱矿后的牙本质组织表面钙和磷的相对原子浓度下降到了9.0%和6.0%，而后经过15%EDTA溶液超声震荡浸泡30 min脱矿处理后的牙本质组织表面，其钙和磷的相对原子浓度则降至7.6%和5.2%。不同脱矿程度的牙本质能谱分析中钙磷相对原子浓度的下降与脱矿程度呈正相关（图4），与拉曼光谱检测结果相一致。
3 讨论
在临床进行牙体缺损修复时，修复体脱落的情况时有发生，主要原因是粘接剂的粘接效果不佳所导致，这与粘接剂的选择、修复体表面的处理以及牙本质表面处理等因素相关[1]。目前，临床使用的粘接系统，不论是自酸蚀粘接系统还是全酸蚀粘接系统，均采用酸蚀处理牙本质表面，在临床使用过程中，医生按照说明进行操作，但对不同性质的牙本质组织没有个性化的酸蚀处理，均采用单一的操作步骤和酸蚀处理时间，这就导致了不同牙本质表面的酸蚀效果不同，从而影响了后期粘接效果[8]。因此，随着今年来的研究，对牙本质表面形态及粘接系统不断深入的了解，国内学者将改善牙本质表面性能作为提高粘接性能的研究重点[9-10]。但是在临床酸蚀过程中，医生无法依靠复杂的实验室仪器来实时、快速、准确地判断不同矿化程度牙本质表面酸蚀处理的情况，因此，提供一种快速、准确、便捷的检测牙本质酸蚀程度的方法可以帮助临床医生更好地判断牙本质酸蚀情况，提高修复体与牙本质粘接性能。
拉曼效应是由印度科学家Raman于1928年发现[11]，并因此而获得诺贝尔物理学奖。其主要原理是根据分子及分子团对入射激光产生非弹性散射形成的光谱（即拉曼光谱）来分析分子及分子团的结构，分子键能之间的变化及特定分子的含量等，被誉为“分子指纹”[12]。近年来随着激光技术及仪器的不断发展，拉曼光谱技术被广泛应用于医学研究领域，为医学领域研究，特别是对疾病鉴别诊断、生物样该组织无创检测等研究提供了一种便捷而准确的新方法[13-14]。薛丽丽等[14]应用拉曼光谱对唇腺炎症组织进行研究发现，正常唇腺组织与慢性炎症唇腺组织的拉曼光谱存在差异，通过分析比较光谱差异，建立鉴别诊断模型，可以应用拉曼光谱对慢性炎性唇腺组织进行鉴别诊断，准确率达到了91.8%。拉曼光谱技术不但能够用于软组织病变的检测研究，同样也适用于硬组织变化的检测研究。Lakshmi等[14]应用拉曼光谱技术研究下颌骨放射性骨髓炎病变，发现960 cm-1波数处谱峰对应骨骼中的磷酸钙盐成分，而2 950 cm-1波数处谱峰对应骨骼中有机组织的C-H键。发现放射性骨髓炎组织内结构发生改变，细胞成分降低，随着骨骼内钙磷成分减少， 960 cm-1波数处谱峰强度降低，而随着有机成分的增加2 950 cm-11波数处谱峰强度增加。以上研究结果与該研究相似。目前，国内外有关牙体硬组织的拉曼光谱研究主要集中在釉质表面酸蚀及牙本质龋坏结构改变的研究，尚无关于牙本质脱矿拉曼光谱定量研究[16-17]。Lemor等[18]在研究牙本质化学酸蚀过程中同样发现，拉曼光谱中960 cm-1谱峰与牙本质中的磷酸钙盐相关。该研究中，不同脱矿程度的拉曼光谱存在差异，其中960 cm-1波数处谱峰对应磷酸根，其强度随着脱矿程度的增加而降低，表明牙本质组织脱矿后羟基磷灰石[Ca10（OH）2（OP4）6]成分减少，这与能谱仪分析牙本质组织表面元素成分相近。而2 950 cm-1波数处谱峰对应的是有机组织成分，其强度随着脱矿程度的增加而增加，说明随着钙磷酸盐的减少，有机组织成分占比逐渐升高。相关研究表面EDTA处理牙本质表面时可以将接近牙本质小管开口5 μm内的钙盐沉积物全部或大部分溶解[10]。而通过拉曼光谱图像对比，可以更直观地观察牙本质组织表面牙本质小孔的变化，从而了解牙本质表面脱矿程度及酸蚀处理情况。
综上所述，拉曼光谱可以检测不同脱矿程度的牙本质组织，主要表现为磷酸根对应的960 cm-1处谱峰及与有机组织相关的C-H键对应的2 950 cm-1处谱峰。随着脱矿程度的变化，拉曼光谱的谱峰也随之改变。表面拉曼光谱可以有效地检测牙本质表面组织的矿化程度及变化情况，可以为临床提供一种快速、便捷、准确、无创及原位实时检测牙本质组织的新方法，具有巨大的应用潜力，但拉曼光谱谱峰强度变化与牙本质脱矿程度的定量关系需要进一步大样本量的研究。
[参考文献]
[1] 张晓燕，吴凤鸣.激光预处理牙本质对树脂粘结性能影响的研究进展[J].口腔医学，2015（1）：76-80.
[2] 黄翠，程祥荣.牙本质粘结剂的回顾、现状和展望[J].中华口腔医学杂志，2006（41）：700-701.
[3] 费健，骆小平，陈亚琴，等.不同表面粒度车针预备所致玷污层对牙本质粘结强度的影响[J].口腔医学研究，23（4）：408-410.
[4] Bing Y， Zhining W， Yi L， et al.An intraoperative diagnosis of parotid gland tumors using Raman spectroscopy and support vector machine[J].Laser Phys，2014（24）：115601.
[5] Bing Y， Bo L， Zhining W， et al.Label-free blood serum detection by using surface-enhanced Raman spectroscopy and support vector machine for the preoperative diagnosis of parotid gland tumors[J].BMC Cancer， 2015（15）：650-658.
[6] McCreadie BR， Morris MD， Chen T，et al.Bone tissue compositional differences in women with and without osteoporotic fracture[J].Bone， 2006：1190-1195.
[7] 薛丽丽，闫冰，李一.拉曼光谱在口腔医学中的应用[J].华西口腔医学杂志，2015（2）：1-4.
[8] 王金花，魏昕.表面处理对硬化牙本质粘结性能影响的研究进展[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2017（27）：290-294.
[9] 康钧棠，李婷婷，夏文薇.EDTA预处理硬化牙本质对树脂粘结强度的影响[J].口腔医学研究，2012（28）：576-579.
[10] 李婷婷，孙敏敏，康钧棠，等.EDTA预处理硬化牙本质前后的电镜观察[J].口腔医学研究，2015（31）：506-510.
[11] 薛丽丽，闫冰，李一.拉曼光谱在口腔医学中的应用[J].华西口腔医学杂志，2015，33（2）：214-217.
[12] Devpura S， Thakur JS， Sethi S，et al.Diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma using Raman spectroscopy： tongue tissues[J].Journal of Raman spectroscopy， 2012（43）：490-496.
[13] Lili Xue，Pei Sun，Dongchen Ou，et al.Diagosis of patholog ical minor salivary glands in Sjogren’s syndrome by using Raman spectroscopy[J].Lasers in Medical Science，2014，29（2）：723-728.
[14] 薛麗丽，欧东晨，陈培琼，等.原发性舍格伦综合征病变唇腺的显微拉曼光谱特征及诊断价值[J].中华口腔医学杂志，2013，48（8）：1-4
[15] Lakshmi RJ，Alexander M， Kurien J，et al. Osteoradionecrossi（ORN） of the mandible： A laser Raman spectroscopic study[J].Applied Spectroscopy， 2003（57）：1100-1116.
[16] Melo MAS， Rolim JPML， Zanin ICJ， et al. A Comparative study of the photosensitizer penetration into artificial caries lesions in dentin measured be the confocol Raman Microscopy[J].Photochemistry and Photobiolgy， 2014（90）：183-188.
[17] Tatiana VK， Randall DS， Paolo SB， et al. Effect of tooth-bleaching agents on phosphate concentration in dental enamel by means of Raman spectroscopy[J].Revista Odontologic Mexicana， 2015（19）：228-e235.
[18] Lemor R， Kruger MB， Wieliczka DM， et al. Dentin etch chemistry investigated by Raman and infrared spectroscopyA[J].Journal of Raman spectroscopy. 2000（31）： 171-176.
（收稿日期：2017-09-23）
